Технология скрининга

В клинике в настоящее время используется порядка двухсот природных и синтетических антибактериальных веществ. Каждое из них имеет свою мишень. Как правило, это или фермент либо рибосомный белок. Для доказательства «существенности» (под «существенностью» подразумевается необходимость гена для жизнедеятельности клетки) генов применяется метод избирательного «выбивания» гена из генома с проверкой выживания организма после такой проуедуры, который представляет большой интерес как технология скрининга антибактериальных (шире – антимикробных) агентов [7].

Традиционно первичный отбор последних проводится путем испытания их действия на рост тест-культуры микроорганизма. Высокоактивные, подавляющие рост вещества, отобранные на этом этапе, проходят дальнейшеие испытания, в частности определяется антимикробный спектр их действя и активность в опытах in vivo на лабораторных животных, а также токсичность как для макроорганизма в целом, так и для отдельных его органов и тканей.

По завершении доклинических испытаний в случае получения положительных результатов препарат передается в клинику. Затем начинается углубленное изучения механизма действия антимикробного агента на субклеточном молекулярном уровнях, то есть ведется поиск его внутриклеточной мишени – макромолекулы или макромолекулярного комплекса – таргета (англ. Target – мишень) по недавно принятой терминологии. Далее выявляется ген, который кодирует образование этой макромолекулы, или гены, кодирующие образование макромолекул, входящих в макромолекулярный комплекс.

По новой технологии скрининга используют информацию о полностью секвенированном геноме патогенна и наличии в нем «существенных» генов. В лабораториях, в которых ведется создание новых лекарств, предварительно выбирается ген, который будет использован, как таргет [2].

Таргетный скрининг позволяет в соответствии с выбором гена отбирать биологически активные вещества с запланированным механизмом действия (в отличие от традиционного метода, когда поиск ведется «от клетки к гену»).

Первый этап таргетного скрининга – это выделение данного гена (соответствующего фрагмента ДНК) из генома. Затем фрагмент ДНК амплифицируется (создается вирусный вектор, который вводится в плазмиду) -количество копий гена умножается. Затем конструируются:

- бесклеточная система, где наработанная матрица служит для получения информационной РНК, специфичной для гена;

- бесклеточная рибосомная система, где эта информационная РНК служит для наработки белкового продукта, кодируемого данным геном.

Бесклеточная система, используемая для первичного отбора и оценки активности потенциальных лекарственных веществ – ингибиторов фермента (продукта изучаемого гена), содержит фермент и его субстрат. Когда наработан белок, возникает вопрос: как узнать функцию этого белка? Существует несколько способов:

- если наработанный белок схож с белком из «модельного» организма, то подобрать бесклеточную систему несложно;

- если сходство есть, но не очень близкое, то прибегают к анализу «мотивов» - коротких участков аминокислотной последовательности, которые распределены по всей длине белковой цепи и могут оказаться сходными у двух белков;

- если сходства не существует, то устанавливают, с какими белками он (наработанный белок) контранскрибируется (переписывается в последовательность матричной информационной РНК).

Таким образом можно проводить серийные испытания потенциальных ингибиторов функций почти любого из тысяч генов, составляющих геном патогенна и обнаруживать все новые «уязвимые точки» микробной клетки.